天正10年（1582年）5月、徳川家康饗応役であった光秀は任務を解かれ、羽柴秀吉の毛利征伐の支援を命ぜられ、同年6月2日（1582年6月21日）早朝に出陣する。その途上の亀山城内か柴野付近の陣で、光秀は重臣達に信長討伐の意を告げたといわれる。軍勢には「森蘭丸から使いがあり、信長が明智軍の陣容・軍装を検分したいとのことだ」として京都へ向かったという。

『本城惣右衛門覚書』によれば、雑兵は信長討伐という目的を最後まで知らされておらず、本城も信長の命令で徳川家康を討つのだと思っていた。光秀軍は信長が宿泊していた京都の本能寺を急襲して包囲した。光秀軍13,000人に対し、近習の100人足らずに守られていた信長は奮戦したが、やがて寺に火を放ち自害したとされている。信長の死体は発見されなかった。

その後、二条新御所にいた信長の嫡男・信忠と従兄弟の斎藤利治が、二条新御所において見事な防戦（奮戦）をしているのを確認し、降伏勧告をしたとされるが、利治は忠死を選んだ。応援に駆け付けた村井貞勝と息子の村井貞成、村井清次や信長の馬廻りたちを共に討ち取った。また津田信澄（信長の弟・織田信行の子）は光秀の娘と結婚していたため、加担の疑いをかけられ大坂で神戸信孝（信長の三男）（織田信孝）に討たれた。

主君・織田信長を討った行為については、近代に入るまでは“逆賊”としての評価が主であった。特に儒教的支配を尊んだ徳川幕府の下では、本能寺の変の当日、織田信長の周りには非武装の共廻りや女子を含めて100名ほどしかいなかったこと、変後に徳川家康が伊賀越えという危難を味わったことなどから、このことが強調された。
本能寺の変後、光秀と関係の深い長宗我部元親、斎藤利堯、姉小路頼綱、一色義定、武田元明、京極高次等が呼応する形で勢力を拡大している。織田政権が崩壊したことで各地に支配の空白が生じ、家康と後北条氏や上杉氏らが甲斐国・信濃国を争奪した天正壬午の乱、紀伊や伊賀の国人衆蜂起などが起きた。